ELISA檢測原理

    酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA）指將抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的有無深淺定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

01

ELISA常見分類

#1

直接ELISA

特點： 在直接ELISA中，被測抗原被固定在多孔板表面，用一種針對該抗原的抗體檢測，該抗體直接與HRP或其他檢測分子結合。

優(yōu)點：簡單快速，避免交叉反應。

缺點：潛在高背景，沒有信號放大。

#2

間接ELISA

特點：固相載體包被抗原，酶標記二抗，主要用于測抗體。 

優(yōu)點：使用酶標二抗增加了靈敏度，靈活大，成本低。 

缺點：交叉反應幾率升高。

用途：通過檢測血清中的抗體來檢測病毒，如第1，2代艾滋病診斷試劑。常用于免疫動物血清中抗體含量的測定。

#3

夾心法ELISA(雙抗體，雙抗原）

雙抗體夾心ELISA法

特點：使用兩個特異性單抗或者1個特異性單抗和1個特異性多抗，固相載體包被抗體，酶標記特異性抗體作為檢測抗體。

優(yōu)點：使用兩個特異性抗體檢測，特異性好。

缺點：成本高。

用途：用于抗原的定量檢測。

雙抗原夾心ELISA法

特點：使用兩個特異性抗原，固相載體包被特異性抗原，酶標記特異性抗原作為檢測抗原，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。

優(yōu)點：靈敏度、特異性高于間接法

缺點：反應時間略長于間接法 

用途：用于抗體的定量檢測。

*RSR多款試劑盒采用橋式ELISA法（基于雙抗原夾心法原理），保證抗體檢測的高特異、高靈敏性。

#4

競爭ELISA

特點：包被抗體，標記抗原，樣本中的抗原與酶標抗原競爭與固相抗體結合，標本中抗原含量越多，結合在固相上的酶標抗原越少，最后的顯色也越淺。

注意：該原理強調抗原與抗體的充分結合，因此溫度、搖床（振速、振幅）、反應時間等因素值得注意！

用途：小分子抗原或者半抗原的定量檢測，當抗原材料中干擾物質不易去除或不易得到足夠的純化抗原時，多用于此方法檢測；一般小分子激素及藥物常用此法測定。

* RSR旗下AChR Ab-ELISA、TRAb 2nd-ELISA、TRAb 3rd-ELISA等都是基于競爭法ELISA的原理基礎上設計的試劑盒，是該項目ELISA定量檢測方法，特異性均達到99%以上。

02

ELISA常見問題

Q1

為什么推薦兩個主波長檢測

(450nm和405nm)？

A: ELISA實驗終止后形成的是黃色物質，該物質需要在450nm處測定其吸光度，當OD450值≥3時，應使用OD405的值進行轉換（乘轉換系數(shù)3.4，參見說明書）。

RSR試劑盒中設計的空白孔屬于試劑空白，建議按照“空白孔+兩次單波長檢測（405nm & 450nm）"完成實驗，無需再設置參考波長（630nm）。

Q2

CV值指的是什么？

A: CV值是統(tǒng)計學中的一個概念，中文是變異系數(shù)，可以認為變異系數(shù)和極差、標準差和方差一樣，都是反映數(shù)據(jù)離散程度的絕對值。CV值越小，說明數(shù)據(jù)的波動程度越小。在描述板內、板間實驗結果是否一致時常用到CV值，其越小，說明批內及批間差越小，試劑盒質量越好。

Q3

標曲擬合方式的最佳方法？

A: 

ELISA數(shù)據(jù)處理中所謂的“標準曲線"其實更適合稱為擬合曲線。標準曲線應根據(jù)不同待測物質的特性和檢測范圍選擇適當?shù)臄M合方式。除常見的直線、多項式曲線、指數(shù)曲線、對數(shù)曲線等外，四參數(shù)Logistic回歸和三次樣條插值cubic spline擬合對定量范圍內全域具有更良好的適用性，能夠比較精確的反映濃度和吸光度間的轉換關系，從而進一步準確獲得樣品中待測物質的濃度值。

在RSR試劑盒中，擬合方式可根據(jù)產(chǎn)品說明書自行選擇4 parameters（四參數(shù)Logistic曲線）或cubic spline（三次樣條/仿樣曲線/樣條曲線等），通過酶標儀搭配的計算軟件完成數(shù)據(jù)的處理，從而快速、準確地完成定量檢測。

Q4

ELISA試劑盒只能檢測血清、血漿、

細胞上清液嗎？

A: 通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，在使用前應留意試劑盒匹配的樣本類型，包括血清、血漿、腦脊液等常規(guī)樣品，以及尿液、細組織勻漿液、細胞裂解液等樣品。對于超出試劑盒適用樣本類型的樣本，市面上很多廠家的產(chǎn)品都沒有相關的驗證數(shù)據(jù)，客戶如有需要可以自行測試。需要注意的是，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。樣品中含有影響生物活性的物質會影響檢測結果。

Q5

試劑盒在使用前要室溫放置30min，

目的是什么？

A: ELISA試劑盒對于溫度的要求比較嚴格，溫度是ELISA結合反應的重要影響因素，這樣做主要是為了使試劑溫度一致，在后面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地滿足測定要求。

Q6

樣本收集后不能及時檢測，低溫保存

可以放多久？

A: 樣本收集后應盡快檢測。如果樣本收集后不能立即檢測時：一周內可檢測則需將樣本置于4℃環(huán)境下，冷藏保存。3年內檢測則需將樣本至于-20℃或更低溫度環(huán)境下保存。

Q7

樣品反復凍融影響大嗎？

A:樣品反復凍融對蛋白影響非常大，能導致蛋白降解，非常不建議反復凍融樣品。一般蛋白含量豐富的樣本例如血清/血漿反復凍融1-2次，對于檢測結果影響不是非常大。

Q8

生物素化制劑和酶結合物，稀釋后沒用完，

還可以再用嗎？

A: 復溶的生物素化制劑和酶結合物建議依據(jù)使用說明書內的有效期和儲存條件使用，放置時間太長可能會影響其活性?？筛鶕?jù)自己實驗所需用量進行配制，不建議過量配制。

Q9

振蕩器的選擇

A: 建議采用酶標板振蕩器(單板/多板)，保持震蕩速率在500 shakes/min。定軌搖床因速率過慢，不建議使用。

當所用產(chǎn)品的檢測原理為競爭ELISA法時，振蕩器的軌道直徑（振幅）更加重要。選好振蕩器能夠確保在競爭法ELISA中抗原與抗體的充分結合，才能得到理想結果。RSR采用德國IKA MTS 2/4振蕩器，如下圖所示。

該產(chǎn)品軌道直徑3mm，支持1-4個ELISA板同時振蕩，且能夠確保微孔板在振蕩時既不會松脫也不會有液體飛濺。當您不確定實驗室的振蕩器是否滿足ELISA實驗規(guī)定時，可進行預實驗以確保得到穩(wěn)定重現(xiàn)性。但這種測試費時費板，建議選擇相關參數(shù)的振蕩器。

Q10

變異系數(shù)(CV)較大的原因？

A: 

Q11

標準曲線較差？

A: 

* 振蕩器的振速與振幅也不容忽視，根據(jù)實驗需要調整振蕩器參數(shù)或更換符合標準的振蕩器。

** RSR ELISA試劑盒標準品可直接使用，避免標準品稀釋、復溶不當?shù)炔僮魇д`。

Q12

高背景或陰性對照值偏高

A: 

*工作臺用漂白劑做過清潔：殘留漂白劑可以氧化TMB導致非特異性高信號，需要去除殘留

Q13

顯色信號弱

A: 

Q14

無顯色信號

A: 

Q15

標曲佳但樣品孔無信號

A: