1.固相載體包被：將純化的谷氨酸脫羧酶抗原或特異性捕獲抗體預(yù)先吸附在微孔板表面，形成固相載體。這一步驟確保后續(xù)反應(yīng)在固定界面進(jìn)行，簡(jiǎn)化操作流程。
2.樣本孵育與結(jié)合：加入待測(cè)樣本后，若其中含有GAD-Ab，則會(huì)與固相載體上的抗原/抗體發(fā)生特異性結(jié)合。通過(guò)37℃溫育優(yōu)化反應(yīng)條件，促進(jìn)抗原-抗體復(fù)合物的形成。
3.洗滌去除干擾：采用緩沖液多次洗滌，清除未結(jié)合成分及非特異性吸附物質(zhì)，降低背景干擾。此步驟對(duì)提高檢測(cè)準(zhǔn)確性至關(guān)重要。
4.酶標(biāo)二抗反應(yīng)：加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，使其與已結(jié)合的GAD-Ab進(jìn)一步結(jié)合，形成“夾心結(jié)構(gòu)”。酶標(biāo)抗體可放大信號(hào)，增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。
5.底物顯色與定量：TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成的黃色。顏色的深淺和樣品中的(GAD)elisa檢測(cè)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。
谷氨酸脫羧酶自身抗體ELISA試劑盒的測(cè)定步驟：
-采集與處理：使用無(wú)抗凝劑或EDTA抗凝管采集靜脈血，離心分離血清/血漿(3000rpm，10-15分鐘)。
-稀釋：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求，用樣本稀釋液將血清/血漿按比例稀釋(如1:100)。
-避免反復(fù)凍融：樣本分裝保存，長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-20℃或-80℃。
-平衡溫度：實(shí)驗(yàn)前將所有試劑(包括標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、洗滌液等)平衡至室溫(20-25℃)。
-配制工作液：
-濃縮洗滌液：按說(shuō)明書比例用蒸餾水稀釋(如1:20)。
-酶標(biāo) conjugate：用相應(yīng)稀釋液配制(如1:100)。
-包被微孔板：已預(yù)包被GAD65抗原的微孔板無(wú)需額外處理。
-加樣順序：
1.空白孔：加入樣本稀釋液(作為零對(duì)照)。
2.標(biāo)準(zhǔn)品孔：梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品(如0、5、10、25、50、100 U/mL)。
3.質(zhì)控孔：高、低值質(zhì)控品。
4.樣本孔：加入稀釋后的待測(cè)樣本(每孔100μL)。
-孵育：37℃溫育30-60分鐘(具體時(shí)間依試劑盒而定)。
-用洗板機(jī)或手動(dòng)洗滌：每孔注入300-500μL洗滌液，浸泡10-15秒，重復(fù)3-5次，拍干殘留液體。
-每孔加入100μL酶標(biāo)二抗(如HRP標(biāo)記的抗人IgG)，37℃孵育30分鐘。
-加入底物液(如TMB)100μL/孔，避光顯色15-30分鐘(顏色由藍(lán)變黃)。
-加入終止液(如2M HSO)50μL/孔，立即測(cè)定吸光度(OD值，波長(zhǎng)450nm)。
-繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(四參數(shù)Logistic回歸)，根據(jù)樣本OD值計(jì)算濃度。
-陽(yáng)性判定：通常以≥臨界值(如10 U/mL)為陽(yáng)性。
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更新時(shí)間：2026-01-13
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